使用siRNA、miRNAmimic、pre-miRNA进行miRNA生物学功能研究的区别

使⽤siRNA、miRNA mimic 、pre-miRNA进⾏miRNA ⽣物学功能研究的区别Frank 20120715

miRNA是⼀类⼤⼩约为22个碱基的⼩RNA分⼦。它们在转录后阶段对基因表达进⾏调控。调控机制是通过与靶基因的mRNA互补序列结合，抑制蛋⽩质的翻译或降低mRNA的稳定性，从⽽抑制靶基因的表达。科研⼈员已逐

步认识到miRNA在细胞的发育，分化，⽣长等⽣命活动中起着⾮常重要的调控作⽤，因此越来越多的科研⼈员把⽬光聚焦到这⼀领域，并期待能⼀窥miRNA的科学奥妙。成熟的miRNA是由较长的初级转录物经过⼀系列核酸酶的剪切加⼯⽽产⽣的，初级转录物称为pri-miRNA。pri-miRNA长度从⼏百到⼏千个碱基不等，带有5‘帽⼦和3’polyA尾巴，以及1到数个发夹径环结构。Pri-miRNA经剪切产⽣约70个碱基的miRNA前体，即

pre-miRNA。pre-miRNA为单⼀发夹结构，

5‘带有磷酸基团，3’有两个突出碱基，并带有3’羟基。pre-miRNA经进⼀步剪切，形成长度约为22个碱基的单链成熟miRNA。由于当前市场上的miRNA产品类型

有诸多不同，因此对于初⼊此领域的科研⼈员来说，选择哪种形式的miRNA进⾏科研试验往往成为困惑。除了构建miRNA表达载体外，市场上⼈⼯合成的miRNA产品主要有siRNA，miRNA mimic，pre-miRNA等⼏种设计类型，实际上不同的类型各有优缺点，科研⼈员应该根据试验的不同要求来进⾏选择，从⽽得到最想要得到的结果。

⼀般来说，采⽤miRNA表达载体能获得稳定表达miRNA的细胞株，但也存在质粒的转染效率要低于RNA oligo，⽆法定量转染，过表达影响细胞内⾮靶基因/功能等缺点，因此⽬前很多研究miRNA的科研

⼈员都选择直接转染物美价廉的⼈⼯合成miRNA产品。miRNA产品中的siRNA，miRNAmimic都是基于内源性pre-miRNA的成熟形式设计⽽来，从⽽使其具备

miRNA⽣物学功能并应⽤于miRNA的功能分析研究，但这些设计也会不同程度的影响细胞或体内的⾮靶基因/功

能。为尽可能降低上述脱靶效应，miRNA mimic 往往还对核苷酸进⾏特定修饰，从⽽筛选出最接近pre-miRNA ⽣物学功能的序列设计，但是通常情况下其功能性及特异性仍稍逊于pre-miRNA 。pre-miRNA 虽然具备独特的优势，但是因为当前RNA 的合成⼯艺⼀直⽆法有效突破50个碱基左右的瓶颈，所以其价格成本较⾼。

已有⽂献报道表明，等量的miRNA mimics 和pre-miRNA 进⼊体外或体内时，pre-miRNA 能更特异地且⾼效的形成maturemiRNA ，并表现出更⾼的⽣物学活性。Richard I. Gregory 等在体外将pre-let-7和let-7 duplex 分别与Dicer-TRBP-Ago2共孵育，然后加⼊靶RNA 进⾏反应。结果表明pre-miRNA 对靶RNA 的剪切活性明显优于miRNA duplex 。Daniela Castanotto 等⽤siRNA 、shRNA 、pre-miRNA 分别或联合转染细胞研究表明，pre-miRNA 不仅与外源siRNA/shRNA 存在的竞争性抑制最⼩，⽽且对内源性其它miRNA 的影响也最⼩。其原因可能是shRNA/siRNA 挤占细胞内有限的RISC 资源，⽽pre-miRNA 具备⾼特异性序列结构避免过度侵占细胞内部资源。

由于miRNA 为内源单链RNA ，对依赖双链RNA 的蛋⽩激酶（PKR ）和寡腺甙酸合成酶（2',5'- oligoadenylate synthetase，2-5A ）⼲扰素诱⽣系统不敏感，PKR 和2-5A 系统只能特异地与双链RNA 结合，不能与单链或RNA-DNA 杂交链结合，因此pre-miRNA 在in vitro/in vovo ⽔平上能⼀定程度的避免细胞毒性，进⽽减少细胞凋亡。

Carol A. Sledz等研究表明短链dsRNA也会诱导产⽣⼲扰素效应，虽然这种效应有时候⽐较弱，但是其具有普遍性且呈剂量依赖性。M Bauer等则通过模拟内源pre-miR-30序列结构设计出amiRNA（artificial miRNA），其有效降低了shRNA的⼲扰素效应，⼲扰素相关基因Oas1及凋亡蛋⽩caspase 3均得到下调。

鉴于pre-miRNA 具有⾼效、低细胞毒性的特点，我们合成了pre-miR-21 和miRNA mimic，以相同剂量转染细胞，然后⽤RT-PCR 检测miRNA-21 成熟体的形成。试验结果表明效果远优于mimics，因此pre-miRNA在系统多因素的研究中具备其更独特的优势！

Reference：

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4.Kazuya Terasawa et al，Synthetic Pre-miRNA-Based shRNA as Potent RNAi Triggers Journal of Nucleic Acids （2011）,1-6。

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9. Carol A. Sledz et al Activation of the interferon system by short-interfering RNA, Nature Cell Biology 2003(9) 834-839.