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EGFR基因突变(ARMS法)检测标准操作规范

来源:爱够旅游网


EGFR基因突变(ARMS法)检测标准操作规范

1、 目的:明确EGFR基因突变(ARMS法)检测操作、结果判断、报告内容及质控管理规程,保证检测结果的可靠性。 2、 执行人:李文辉、郭志云

3、 试剂来源:苏州为真生物医药科技有限公司 4、 质控物:阴性、阳性对照均为试剂配套。 5、 实验操作步骤: 5.1 DNA提取

FFEP样本DNA的提取(QIAGEN)

(1)切片、烤片:切3~5张厚度为8~10μm的组织片,捞至普通玻片上(若为

小组织,则切10张,同一玻片可捞多张),60℃考片30分钟;大组织另外切一张3μm组织片进行常规HE染色,作病理评估之用。 (2)脱蜡:将组织切片置于二甲苯中室温脱蜡2次,每次10min;随后浸入100%乙醇3min。将组织切片依次室温置于100%、80%、70%梯度乙醇中各2min,

复水后,室温浸入去离子水3min。

(3)评估、刮片:组织片经病理评估后,用洁净盖玻片刮取癌组织密集区域,

并转移至洁净的1.5ml EP管中;小组织全部刮取至1.5ml EP管中。

(4)消化:加入180μl ATL和20μl蛋白酶K,震荡混匀,根据组织大小可增加

消化液的用量,56℃,1h,根据组织大小可延长消化时间甚至过夜消化(期间可以适当摇晃颠倒样品,使之混匀裂解充分;可裂解至组织消化完)。 (5)升温:将温度调至90℃,作用1h(注意管盖,90℃高温可能会导致爆盖以

致液体被蒸发;时间不要太长1小时足够;一个水浴锅时,56℃到90℃之间过渡时应将样本置于室温中,待温度完全升到90℃后再将样本放进去)。 (6)短暂离心使液体聚于管底,加入200μl AL,震荡混匀,然后加入200μl无

水乙醇,震荡混匀。

(7)短暂离心使液体聚于管底,将整个液体全部移入收集柱中,然后8000rpm

离心1min,丢弃收集管后将收集柱至于新的收集管中。

(8)加入500μl AW1漂洗液,离心8000rpm,1min,丢弃收集管后将收集柱至

于新的收集管中。 (9)加入500μl AW2漂洗液,离心8000rpm,1min,丢弃收集管后将收集柱至

于新的收集管中。

(10)离心14000rpm,3min,以去除收集柱中的残余液体。 (11)开盖后放置5-10min,以去除残余乙醇。 (12)加入洗脱液20μl,然后室温静置5min。 (13)离心14000rpm,1min,收集洗脱液。

新鲜组织样本(TIANGEN)

(1)新鲜组织取量30-50mg(脾组织用量应小于10mg),使用剪刀或者匀浆器将组织剪碎(尽量越碎越好,形成细胞悬液),然后10000rpm离心1分钟,

倒尽上清后加入200μl缓冲液GA,震荡悬浮。

(2)加入20μl蛋白酶K溶液,混匀后在56℃放置,直至组织熔解(1-3小时,

期间注意颠倒样本几次,以混匀使裂解充分)。

(3)短暂离心使液体聚于管底,加入200μl缓冲液GB,充分颠倒混匀,70℃放

置10分钟。(加入GB时可能会产生白色沉淀,70℃之后会消失变清亮,如果未变清亮说明细胞裂解不彻底)。

(4)短暂离心使液体聚于管底,加入200μl无水乙醇,充分振荡混匀15秒,此

时可能会出现絮状沉淀。

(5)短暂离心使液体聚于管底,将管中全部液体及絮状沉淀全部加入到吸附柱中,12000rpm离心30秒,倒掉废液后将吸附柱继续放回收集管中。 (6)加入500μl缓冲液GD,12000rpm离心30秒,倒掉废液,将吸附柱放回收

集管中。 (7)加入700μl漂洗液PW,12000rpm离心30秒,倒掉废液,将吸附柱放回收

集管中。加入500μl漂洗液PW,12000rpm离心30秒,倒掉废液,将吸附柱放回收集管中。

(8)12000rpm离心2分钟,丢掉收集管,将吸附柱置于室温数分钟,以彻底晾

干残余漂洗液。 (9)将吸附柱置于一个新的干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl

洗脱缓冲液TE,室温静置5分钟,12000rpm离心2分钟,收集洗脱液。 5.2实验仪器及试剂的准备

(1)打开仪器开关,仪器进行自检后,确认指示灯显示正常可以使用时,进行

后续操作,仪器待用。

(2)冰盒的准备:制备碎冰,以便放置试剂以及冰上进行实验操作。

(3)试剂的处理:将试剂盒中的试剂置于冰上自然解冻,其中聚合酶需要插入

冰中,以保护酶的活性。

(4)移液器及耗材的准备:准备好无菌干净的移液器、吸头、PCR管等,确保

使用的材料不能对实验结果产生影响。 5.3 DNA浓度测定(PCR法)

(1)将已解冻的试剂包括八连管、DNA样本、纯化水,振荡混匀后进行快速离

心,然后再置于冰上;DNA聚合酶快速离心后置于冰上。 (2)对需要配制的试剂进行成分计算:

加入组分 PCR MIX DNA聚合酶 纯化水 总体系

体积×n.2(如三份样本则×3.2) 10ul 0.2ul 7.8ul 10ul

(3)在PCR管冰架上,架上洁净的八联管。

(4)将反应混合物依次加入八联PCR管中,每孔加入18ul,然后小心盖上八联

PCR管管盖(不要污染膜或者管盖的表面,以致影响荧光检测)。

(5)依次加入样本DNA、10倍稀释DNA、100倍稀释DNA、标准品DNA、

纯化水(阴性对照)各2ul,反应总体系20ul。

(6)将加样后封闭好的PCR板或八联管振荡混匀,然后离心使液体聚于管底。 (7)按下PCR仪上的出舱按钮,将PCR板或八联管放于舱中,然后再按以下

按钮进舱送入荧光定量PCR仪中。

(8)仪器显示正常,然后编辑反应程序,选择SYBE GREEN反应程序(如果

是第一次使用,请保存此反应模板,以便下次进行实验):

第一阶段 酶激活阶段: 95℃ 5min 第二阶段PCR扩增阶段:95℃ 10s

40循环 60℃ 15s

72℃ 35s(荧光) 第三阶段 冷却过程: 40℃ 10s

(9)实验结束后,选择浓度(Ct值)接近标准品(10ng/ul)的样本DNA稀释

度进行下一步操作。 5.4试剂配制及程序设置

(1)将已解冻的试剂包括八连管、样本DNA、纯化水,振荡混匀后进行快速离

心,然后再置于冰上;DNA聚合酶快速离心后置于冰上。 (2)对检测需要配制的试剂进行成分计算:

加入组分

样本DNA/阳性质控/纯化

DNA聚合酶 纯化水 总体系

体积 2ul 0.2ul 7.8ul 10ul

×8.2 16.4ul 1.64ul 63.96ul 82ul

按照上表计算的量配制各各样本的MIX混合液。 (3)在PCR管冰架上,轻轻揭开八联管管盖。

(4)将MIX依次加入八联PCR管中,每孔加入10ul,一个MIX对应一条八联管,然后小心盖上八联PCR管管盖(不要污染膜或者管盖的表面,以致影响荧光检测)。

(5)将加样后封闭好的PCR板或八联管振荡混匀,然后离心使液体聚于管底。 (6)按下PCR仪上的出舱键,将PCR板或八联管放于舱中,然后点击进舱送

入荧光定量PCR仪中。

(7)仪器显示正常,然后编辑反应程序,选择Tapman反应程序(如果是第一

次使用,请保存此反应模板,以便下次进行实验):

第一阶段 酶激活阶段: 95℃ 5min

40循环 第二阶段PCR扩增阶段:95℃ 20s

60℃ 40s (荧光) 第三阶段 冷却过程: 40℃ 10s

6、结果分析

(1)软件操作流程参照ABI7500操作手册。

(2)实验结束以后在FAM通道,运行外控(Control)Ct值的计算,一般Ct值

≤34.0,可以继续分析,如果Ct值>34.0,则说明样本DNA降解严重,不适合实验需求。

(3)运行无模板对照(NTC)时,FAM信号无曲线升起,说明实验无污染存在,

可以继续分析实验情况。当Ct值≥35.0时,有微弱的扩增信号,对实验的

影响极微,可以继续分析实验情况。

(4)运行阳性质控品,所有阳性质控Ct值一般小于30.0,但可能会由于不同仪

器的不同阈值设置而发生波动。 (5)在FAM通道中运行Ct的计算,结果判断见下表。 阳性 阴性 E19-del 曲线呈S型且C≤34.0 无扩增曲线或Ct值≥35.0 E20ins 曲线呈S型无扩增曲线或Ct值≥35.0 G719X 曲线呈S型无扩增曲线或Ct值≥35.0 T790M 曲线呈S型无扩增曲线或Ct值≥35.0 L858R 曲线呈S型无扩增曲线或Ct值≥35.0 L861Q 曲线呈S型无扩增曲线或Ct值≥35.0 S768I 曲线呈S型无扩增曲线或Ct值≥35.0 且Ct≤34.0 且Ct≤34.0 且Ct≤34.0 且Ct≤34.0 且Ct≤34.0 且Ct≤34.0 可疑 阳性 34<Ct<35 34<Ct<35 34<Ct<35 34<Ct<35 34<Ct<35 34<Ct<35 34<Ct<35

7、质量控制 7.1判断项目

(1)HE染色片:实验之前必须设置HE切片对照并对样本进行病理评估,手术

标本须明确肿瘤组织集中区域,避开坏死和炎症组织;活检标本须保证有足够的肿瘤细胞。 (2)设置阴阳对照:每次实验以ddH2O作阴性对照,阳性标准品作阳性对照(均为试剂盒内提供),以排除实验操作失误引起的判断误差。 7.2实验结果无效的判断标准

(1)样本外控(Control)没有扩增曲线,或Ct值>34.0。 (2)阴性对照出现扩增曲线,且Ct值<35。

(3)阳性对照没有扩增曲线,或Ct值>30.0(会由于不同仪器的不同阈值设置

而发生波动)。 7.3实验结果有效性判断

(1)样本外控(Control)出现扩增曲线且Ct值≤34.0。

(2)阴性对照没有扩增曲线,或Ct值≥35.0。

(3)阳性对照出现扩增曲线且Ct值≤30.0(会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动)。

7.4实验结果判断为无效时的处理

(1)阳性对照及阴性对照信号有效而待检样本结果判断无效,则根据该标本特

征,分析可能失败的原因(除组织本身因素外),改良实验细节,重新检测。 (2)如对照及待检样本结果判断均不理想时,注意检查试剂适用日期,更换试

剂,重新检测。

(3)如仍无法检测出信号,确定为组织本身因素(如组织处理不当或肿瘤成分

过少)时,应向临床或患者提出能否更换样本重新检测,如仍无法检测,应在报告中指出检测失败原因,附结果图,由主任复查后签出报告,并在《分子病理结果异常登记表》上做好登记。 8、报告内容 8.1检测成功

依据检测结果判断,报告检测标本有无基因突变。 8.2检测失败

除操作及试剂因素外,简要说明检测失败原因,例如:由于标本质量欠佳,扩增信号不出,未能检测EGFR基因突变状况。

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